基因合成方法及產業現狀介紹

 基因合成是指在體外人工合成雙鏈DNA分子的技術?；蚝铣墒怯萌斯し椒ê铣苫虻募夹g，是基因獲取的手段之一，相對于從已有生物中獲取基因來說，基因合成無需模板，因而不受基因來源限制。

 

什么是基因合成

 

基因合成是依照某一蛋白質的基因序列，設計合成相互重疊的單鏈寡核苷酸，再通過重疊延伸PCR法拼接出全長，基因合成無需模板，是獲取基因的手段之一以提高在異源宿主的表達量行全基因合成，目前該技術主要應用在基因的異源表達上，對基因密碼子優化后進。

 

此外，基因合成技術還用于合成一些不易獲取模板的基因或者自然界不存在的新基因等?；蚝铣杉夹g可以按照人們的意愿設計且靈活地合成，正好符合了當代生物學發展的潮流，將會在越來越多的領域得到應用，并且發揮巨大的作用。

 

基因合成的方法主要有組裝PCR重疊延伸PCR、TBIO法、PTDS法等。困擾全基因合成技術的問題主要有2個：①合成基因中堿基錯誤率高。②合成成本高。

 

在基因合成前，為使基因在不同生物表達體系中都能得到良好表達，研究人員通常會對基因進行密碼子優化。遺傳密碼有64種，但是絕大多數生物傾向于利用這些???碼子中的一部分，那些被最頻繁利用的稱為最佳密碼子，那些不被經常利用的稱為稀有或利用率低的密碼子。

 

實際上用做蛋白表達或生產的每種生物(包括大腸桿菌，酵母，哺乳動物細胞，植物細胞和昆蟲細胞)都表現出某種程度的密碼子偏愛性，因此，重組蛋白的表達可能受密碼子利用的影響(尤其在異源表達系統中)。

 

在不改變其編碼蛋白的情況下，對一個蛋白的編碼基因進行改變，去除稀有密碼子，合理優化其mRNA二級結構，GC含量等的過程叫密碼子優化。密碼子優化的原理即根據將要使用的表達系統的密碼子偏愛性，針對目標蛋白序列中的每一個氨基酸選擇不同的密碼子進行全序列的組合，找出其中*的一條。

 

1、引物合成

 

研究人員根據自己的意愿確定合成的基因序列后，由于沒有模板，首先需根據待合成的雙鏈DNA設計引物、合成引物。引物，又名引子，是一小段單鏈DNA或RNA，作為DNA復制的起始點，在核酸合成反應時，作為每個多核苷酸鏈進行延伸的出發點而起作用的多核苷酸鏈。

 

在PCR(聚合酶鏈式反應)技術中，已知一段目的基因核苷酸序列，根據這一序列合成引物，利用PCR擴增技術，目的基因DNA受熱變性后解鏈為單鏈，引物與單鏈相應互補序列結合，然后在DNA聚合酶作用下進行延伸，如此重復循環，延伸后得到的產物同樣可以和引物結合。

 

簡單地說，引物即是短的單鏈DNA或短的RNA鏈，序列長度一般為15～90nt(nt為引物堿基單位，有些也用nt或bp標識)，一般不超過120nt。目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺三酯法。亞磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶聯以及起始反應物比較穩定的特點。亞磷酰胺三酯法是將DNA偶聯在固相載體上完成DNA鏈的合成的，引物合成的方向依據既定引物序列由3'端向5'端延伸，相鄰的核苷酸通過3'→5'磷酸二酯鍵連接。

 

2、引物互為模板PCR擴增

 

引物合成后，引物之間互為模板進行PCR擴增。PCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。

 

PCR由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成：

 

①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備;

 

②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合;

 

③引物的延伸：DNA模板-引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈。

 

重復循環變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

 

 

3、連接轉化、菌檢送測

 

通過PCR反應，可擴增出我們需要的雙鏈DNA。但PCR產物穩定性較低，我們需將連接到質粒上，轉化進感受態中，涂平板過夜培養。第二天早上就可以從平板中挑選陽性克隆，挑到的克隆需要再次使用菌落PCR驗證是否有全長的基因插入，使用首尾引物進行PCR，如果有產物，說明有目的基因。將驗證過的克隆轉化進入試管培養搖菌，之后，抽提質粒，純化送去進行測序。

 

4、一代測序

 

目前，我們采用的是一代測序，也叫sanger測序。Sanger法測序利用一種DNA聚合酶來延伸結合在待定序列模板上的引物，直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測定由一套四個單獨的反應構成，每個反應含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入*的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。

 

由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止。終止點由反應中相應的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對濃度可以調整，使反應得到一組長幾百至幾千堿基的鏈終止產物。

 

它們具有共同的起始點，但終止在不同的核苷酸上，可通過高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理后可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標記進行檢測。

 

5、QC驗證

 

將測序結果與目標基因進行比對，同時進行QC酶切驗證，如果測序結果與酶切驗證結果均正確，就完成目的基因的合成了。按照上述步驟，順利的情況下5天時間就能合成出一段800bp左右的基因序列。

 

目前，基因合成周期短，同時可以保證序列的100%正確無誤，具有很大的靈活性，可以對基因的酶切位點和基因序列進行修改，方便下游的克隆和實驗;研究人員根據自己的意愿設計得到自然界中很難獲得甚至不存在的基因;基因合成的基因可以進行密碼子優化，使基因在各種生物表達體系中都能得到良好表達。

 

這些優點使得基因合成在生物領域有著廣泛應用，比如克隆人鼠抗體或重組抗體、合成不同的基因突變株、SNPS或其他突變株、設計合成DNA疫苗、大量合成用于微芯片的cDNA等?；蚝铣杉夹g的發展使生物領域又上了一個新臺階。

 

基因合成產業

 

美國基因合成產業發達，有賴于發達的生物產業，政府與企業在基因業務上投入比較大，而國內大批量投入的科研產業少，基因合成市場有限，客戶主要是科研單位。未來中國的基因合成產業，很大程度上受到國家對生物產業的政策引導的影響。

 

國外分析機構的數據顯示，2014年全球包括工業級和科研級在內的合成基因市場規模為20億美元，其中中國1.2億美元，僅占6%。這個小數據表明，國內生物產業自己研發的東西太少，大部分國內生物制藥企業，還是持續依靠復制國外技術，甚至等技術過期后直接拿來用，這樣并不需要合成基因。

 

因為合成基因只有在前期研發的時候才有較大的應用空間，如果研發投入少，基因合成出來沒有消耗的市場，投入相應就會小很多。國內生物制藥企業長期只是模仿，路會越走越窄，發展到一定程度就會遇到很大的瓶頸。

 

 

從另一方面看，各國的生物產業都受到一定的限制，這是由行業特征決定的：生物產業是一個長期投入、高投入、成功率不高的產業，不像其他行業那樣能更快地產業化。

 

經過十幾年的發展，整個基因合成行業已經很成熟，然而，也引發了一系列行業問題。由于進入門檻低、競爭無序，國內企業不得不憑借國內人力成本低的優勢，趨向到國外接單、國內合成的業務。

 

基因合成入行門檻不高，一些小的公司買一臺儀器，三四個人就可以從事這項工作，一個人去跑市場，攢夠訂單后就能開機。

 

基因合成行業拼的主要是儀器的通量。企業開機一次合成低于1000條BP是虧錢的，大規模、大通量才可以降低成本。

 

擠入這個行業者眾多，但基因合成技術還處于1.0版本，合成能力有限、合成周期較長、通量不高，因此，成本高。合成價格對于需求方而言仍然昂貴，也是國內基因合成產業發展緩慢的主因之一。